Ako navrhnúť priméry pre mutagenézu riadenú webovým serverom
Obsah:
Miestne riadená mutagenéza (SDM) je in vitro metóda vytvárania mutácie v známej sekvencii. Často sa vykonáva metódami založenými na PCR. V miestne cielenej mutagenéze sa typicky zmení jedna alebo dve bázy. Priméry môžu byť navrhnuté s požadovanými mutáciami na zavedenie malých zmien do nukleotidovej sekvencie. Na zavedenie rozsiahlych mutácií je možné použiť predĺženie priméru a inverznú PCR. Tento prístup môže zmeniť zloženie aminokyselín konkrétneho proteínu. Miestne cielená mutagenéza sa používa na štúdium zmien aktivity bielkovín. Používa sa tiež na výrobu fúznych proteínov.
Pokryté kľúčové oblasti
1. Čo je to Site-Directed Mutagenesis (SDM) - Definícia, úloha, metóda 2. Ako navrhnúť priméry pre mutagenézu zameranú na miesto - Náhrady, výmazy, vložky
Kľúčové pojmy: delécie, inzercie, mutácie, miestne riadená mutagenéza, substitúcie, tradičná PCR
Čo je mutagenéza zameraná na miesto
Miestne cielená mutagenéza je technika molekulárnej biológie používaná na zavedenie špecifických zmien do nukleotidovej sekvencie génu. Používa sa na zmenu sekvencie aminokyselín proteínu, zavedenie alebo odstránenie reštrikčných miest, zničenie miest viažucich transkripciu a vytváranie fúznych proteínov.
Proces
Počas miestne cielenej mutagenézy sú mutácie zavedené do plazmidov pomocou primérov, pozostávajúcich z požadovanej mutácie. Celý templát je amplifikovaný pomocou PCR, začlenením mutácie do templátu. Potom sa rodičovský templát odstráni zo vzorky s použitím enzýmu, od metylácie závislej endonukleázy. Produkt PCR alebo molekula plazmidu s prasklinami s požadovanou mutáciou sa transformujú na baktérie. Plazmidy môžu byť izolované z baktérií s požadovanými modifikáciami. Proces miestne cielenej mutagenézy je znázornený na obrázku 1.
Obrázok 1: Site-Directed Mutagenesis
Na zavedenie požadovaných mutácií v miestne cielenej mutagenéze sa používajú tri hlavné typy metód. Ide o tradičné PCR, predĺženie primérov a inverzné PCR. Na zavedenie rozsiahlych nukleotidových zmien je možné použiť predĺženie priméru a inverznú PCR.
Tradičná PCR
Na zavedenie jednej alebo dvoch nukleotidových zmien do cieľovej sekvencie s modifikovanými primermi je možné použiť tradičnú PCR. Zmeny môžu byť nukleotidové substitúcie, delécie alebo adície. Mutácia je začlenená do amplikónu počas PCR. Pôvodná sekvencia je preto nahradená mutovanou sekvenciou v priméri.
Predĺženie základného náteru
V predĺžení priméru je požadovaná mutácia začlenená počas vnorenej PCR. Tu je cieľová sekvencia lemovaná dvoma primermi. Požadovaná mutácia je začlenená do vnútorného priméru a mutácia je zavedená v druhom kole PCR. Špecifickosť reakcie PCR všeobecne klesá so zvýšeným počtom nesprávne spárovaných nukleotidov v primeroch. Na predĺženie priméru je však možné použiť dlhé vnútorné priméry s rozsiahlymi mutáciami, pretože vnorená PCR môže zvýšiť špecifickosť reakcie PCR.
Inverzná PCR
Inverzná PCR je metóda amplifikácie neznámych fragmentov DNA navrhnutím primérov na známu sekvenciu DNA. Môže sa použiť na substitúciu, vymazanie alebo vloženie nukleotidov vo veľkom meradle.
Aplikácie miestne cielenej mutagenézy sú popísané nižšie.
- Študovať štruktúru, funkciu a katalytické vlastnosti bielkovín
- Na zlepšenie vlastností bielkovín (proteínové inžinierstvo)
- Zaviesť alebo odstrániť reštrikčné endonukleázové stránky.
Ako navrhnúť priméry pre mutagenézu zameranú na miesto
Miestne cielená mutagenéza je proces zavedenia požadovanej mutácie pomocou priméru. Mutáciou môže byť substitúcia, inzercia alebo delécia. Pretože špecificita PCR klesá s rastúcimi nezhodnými nukleotidmi v priméri, tradičná PCR môže do cieľovej sekvencie zaviesť iba jednu alebo dve zmeny párov báz. Na zavedenie rozsiahlych mutácií je možné použiť aj iné metódy, ako je predĺženie priméru a inverzná PCR. Dizajn priméru v miestne cielenej mutagenéze je znázornený na obrázku 2.
Obrázok 2: Primery pre miestne riadenú mutagenézu
Striedanie
Na substitúcie by jeden z dvoch primérov mal obsahovať požadovanú mutáciu v strede primeru. Tu miesto, ktoré obsahuje mutáciu, nespája s cieľovou sekvenciou, pretože vytvára skreslenie.
Vymazanie
Pokiaľ ide o delécie, sekvenciu, ktorá sa má odstrániť z cieľa, je možné počas návrhu priméru zanedbať. Pretože je táto sekvencia umiestnená oddelene od lemovanej oblasti primérmi, nebola by amplifikovaná počas PCR.
Vloženie
Pri inzerciách je sekvencia, ktorá sa má pridať, zapletená do 5 'konca jedného z primerov počas návrhu priméru. Vložená sekvencia preto môže zostať pripojená aj k amplikónu.
Záver
Miestne cielená mutagenéza je technika používaná na zavedenie mutácií do sekvencie DNA. Tieto mutácie môžu byť substitúcie, inzercie alebo delécie. V tradičnej PCR je možné zaviesť mutácie v malom rozsahu. Mutácie vo veľkom meradle môžu byť zavedené do predĺženia priméru alebo inverznej PCR. Zavedenie mutácie sa uskutoční začlenením požadovanej mutácie do priméru.
Referencia:
1. „Metódy miestne orientovanej mutagenézy“. INTEGROVANÉ TECHNOLÓGIE DNA, K dispozícii tu.
Obrázok so súhlasom:
1. „Site Directed Mutagenesis“ od Knbusby - vlastná práca (verejná doména) prostredníctvom Commons Wikimedia
