Sekvenovanie DNA je technika, ktorá pomáha určiť nukleotidovú sekvenciu konkrétnej molekuly DNA. Dva spôsoby sekvenovania sú Sangerovo sekvenovanie a sekvenovanie novej generácie. Oba typy sekvenčných metód sú až doteraz plne automatizované. Akýkoľvek reťazec DNA sa skladá zo štyroch nukleotidov: adenínu (A), guanínu (G), cytozínu (C) a tymínu (T). Nukleotidy vo fragmente DNA sú označené štyrmi oddelenými fluorescenčnými markermi v oboch typoch sekvenčných metód. Fluorescenčné markery alebo fluorofory sú molekuly schopné absorbovať svetlo a vyžarovať ho na dobre definovanej vlnovej dĺžke. Fluorescenčné markery sú začlenené do reťazca DNA pomocou PCR. Potom je sekvencia nukleotidov určená automatizovanými technikami.

Pokryté kľúčové oblasti

1. Čo je to sekvenovanie -Definícia, Sangerovo sekvenovanie, sekvenovanie ďalšej generácie 2. Ako fluorescenčné markery pomáhajú určiť sekvenciu nukleotidov - Postup sekvenovania

Kľúčové pojmy: dideoxynukleotidy (ddNTP), fluorescenčný marker, gélová elektroforéza, sekvenovanie novej generácie, nukleotidová sekvencia, PCR, sekvenovanie podľa Sangera

Čo je to sekvenovanie

Sekvenovanie je laboratórna technika používaná na stanovenie nukleotidovej sekvencie molekuly DNA. Dva hlavné typy sekvenčných metód DNA je možné identifikovať ako Sangerovo sekvenovanie a sekvenovanie novej generácie. Sangerove sekvenovanie aj sekvenovanie novej generácie používajú na stanovenie nukleotidovej sekvencie značené nukleotidy s fluorescenciou.

Sangerovo sekvenovanie

Sangerovo sekvenovanie je prvou vyvinutou metódou sekvenovania DNA. Metódu sekvenovania prvýkrát vyvinul Fredric Sanger v roku 1975. V dôsledku toho je známa ako Sangerove sekvenovanie. Spôsob Sangerovho sekvenovania je tiež známy ako metóda ukončenia reťazca pretože sa podieľa na selektívnej inkorporácii dideoxynukleotidov ukončujúcich reťazec (ddNTPS) DNA polymerázou počas syntézy DNA in vitro. Predĺženie reťazca DNA sa dosiahne pravidelnými deoxynukleotidmi (dNTP). Do reakčnej zmesi sa však pridajú ddNTPs, aby sa zastavil rast reťazca. Tieto ddNTP sú fluorescenčne označené. Štyri typy ddNTP sú pridané do štyroch oddelených zmesí PCR. Preto sa uskutočňujú štyri oddelené reakcie PCR pridaním ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP. V každej reakčnej zmesi je rast reťazca ukončený na každom A, G, C a T nukleotide. Napríklad v reakčnej zmesi s pridaným ddATP je rast rôznych amplikónov ukončený na každom A nukleotide vo fragmente DNA. Potom sa tieto štyri reakcie oddelia gélovou elektroforézou a na skenovanie oddelenej fluorescencie sa použije fluorometer. Sangerove sekvenovanie je široko používané na stanovenie sekvencie fragmentov použitých pri klonovaní DNA a fragmentov amplifikovaných pomocou PCR. Stanovené nukleotidové sekvencie sú znázornené na obrázku 1.

Obrázok 1: Sekvencie DNA

Sekvenovanie ďalšej generácie

Najnovšie technológie sekvenovania DNA súhrnne označované ako sekvenovanie novej generácie. Sekvenčné reakcie sa vykonávajú v mikroškále na čipe naraz. Preto sa paralelne vykonáva niekoľko sekvenčných reakcií. V sekvenovaní ďalšej generácie sa okrem gélovej elektroforézy na kapilárnu elektroforézu používa aj separácia amlikonov rôznych dĺžok vytvorených metódou ukončenia reťazca. Kapilárna elektroforéza je analytická separačná metóda, ktorou sa molekuly separujú na základe ich elektroforetickej pohyblivosti.

Ako výrobcovia fluorescencií pomáhajú určiť sekvenciu nukleotidov

Počas sekvenovania slúži DNA, ktorá sa má sekvenovať, ako templátový reťazec na syntézu DNA pomocou PCR. Na zahájenie syntézy DNA polymerázou DNA sa používa DNA primer. Ako zložky reakcie PCR sa pridá zmes pravidelných štyroch báz (dNTP; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) a nízkej hladiny jedného zo štyroch dideoxynukleotidov (ddNTPs, ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP). Pridaním každého zo štyroch ddNTP sa teda uskutočnia štyri jednotlivé reakcie PCR. Dideoxynukleotidy majú dve špeciálne vlastnosti:

1. Chýba im 3’-OH skupina, do ktorej je prichádzajúci nukleotid pridaný DNA polymerázou. Začlenenie ddNTP teda zastaví rast reťazca.
2. Sú označené rôznymi fluorescenčnými farbivami: ddATP je označený zeleným farbivom, ddGTP je označený žltým farbivom, ddCTP je označený modrou farboua ddTTP je označený červeným farbivom.

DdNTPs ukončujúce reťazec sa však pridávajú v nízkych koncentráciách; neukončia celý proces PCR naraz. Ale keď je jeden zo štyroch ddNTP začlenený do rastúceho reťazca, tento konkrétny rast reťazca je ukončený. Preto na konci každej zo štyroch reakcií PCR sa vyrobí séria amplikónov (výsledné fragmenty DNA pomocou PCR), ktoré sa ukončia na každom nukleotide cieľového fragmentu DNA. Tieto amplikóny je možné prevádzať v géli. Fluorescenčné farbivá, ktoré prechádzajú v definovanom bode elektroforetického gélu, je možné skenovať pomocou fluorometra, aby sa určila nukleotidová sekvencia v automatizovaných sekvenátoroch DNA. Fluorescenčne značená nukleotidová sekvencia získaná pri sekvenovaní DNA je znázornená na obrázku 2.

Obrázok 2: Fluorescenčne označená nukleotidová sekvencia

Kombináciou každého z nukleotidov v sérii je možné určiť nukleotidovú sekvenciu počiatočného fragmentu DNA. Nukleotidovú sekvenciu fragmentu so 750 až 1 000 pármi báz je možné ľahko určiť na jeden beh Sangerovým sekvenovaním. Sekvenovanie celého genómu však stále zostáva napadnuteľné kvôli prítomnosti veľkého počtu nukleotidov. Sekvenovanie 454 je typ sekvenovania ďalšej generácie, pomocou ktorého je možné prečítať 20 miliónov párov báz na jeden beh.

Záver

Sekvenovanie je technika používaná na stanovenie nukleotidovej sekvencie konkrétneho fragmentu DNA. Sekvencovanie podľa Sangera a sekvenovanie ďalšej generácie sú dve hlavné technológie sekvenovania. Obe technológie používajú na stanovenie nukleotidovej sekvencie fluorescenčné markery. Každý zo štyroch dideoxynukleotidov ukončujúcich reťazec je označený štyrmi rôznymi fluorescenčnými farbivami a na získanie sekvencie sa použijú v štyroch oddelených reakciách PCR.

Referencia:

1. Adams, Jill U. „Technológie sekvenovania DNA“. Nature News, Nature Publishing Group, k dispozícii tu. 2. Carr, Steven M. Fluorescenčné sekvenovanie, dostupné tu. 3. „Sekvenovanie DNA - automatické sekvenovanie s fluorescenčnými farbivami.“ Články JRank, dostupné tu.

Obrázok so súhlasom:

1. „Alineando secuencias (2)“ od Shauryho Nasha (CC BY-SA 2.0) cez Flickr 2. „Radioactive Fluorescent Seq“ od Abizara na anglickej Wikipedii (CC BY-SA 3.0) cez Commons Wikimedia