Hlavný rozdiel-PCR vs. RT-PCR

PCR a RT-PCR sú dve dôležité techniky v molekulárnej biológii. PCR vyvinula Kary Mullis v 80. rokoch minulého storočia. Je schopný exponenciálnym spôsobom zvýšiť počet kópií konkrétneho génu, čo uľahčuje detekciu tohto konkrétneho fragmentu DNA. Taq polymeráza je enzým, ktorý sa najčastejšie používa v systémoch PCR. Je to termostabilný enzým. Pri RT-PCR nasleduje po reverznej transkripcii PCR. Enzým, reverzná transkriptáza, sa podieľa na syntéze komplementárnej DNA z RNA. The hlavný rozdiel medzi PCR a RT-PCR je to PCR používa ako templát dvojvláknovú DNA, zatiaľ čo RT-PCR používa RNA ako templát.

Pokryté kľúčové oblasti

1. Čo je to PCR - Definícia, proces, aplikácia 2. Čo je RT PCR - Definícia, charakteristika, aplikácia 3. Aký je rozdiel medzi PCR a RT PCR - Porovnanie kľúčových rozdielov

Kľúčové pojmy: PCR, RT-PCR, polymerázová reťazová reakcia, reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia, DNA templát, DNA polymeráza, denaturácia, žíhanie, predĺženie primeru

Čo je to PCR

PCR (Polymerická reťazová reakcia) je pomerne jednoduchá, ale revolučná metóda. PCR využíva schopnosť enzýmu, DNA polymerázy, syntetizovať nové vlákna DNA komplementárnym spôsobom k ponúkanému templátovému vláknu. PCR je nepostrádateľná technika používaná v klinických aj výskumných laboratóriách na funkčnú analýzu génov, diagnostiku a monitorovanie dedičných chorôb, klonovanie DNA, sekvenovanie a starodávnu amplifikáciu DNA. Šablóna DNA, nukleotidy, priméry a DNA polymeráza sú štyri hlavné zložky PCR. The Templát DNA je obvykle dvojvláknová DNA s cieľovou sekvenciou, ktorá sa má amplifikovať. Taq DNA polymeráza ktorý je izolovaný z Thermus aquatics, sa bežne používa v PCR. The Pfu DNA polymeráza je ďalší typ DNA polymerázy s vysokou vernosťou. Polymerázy Taq aj Pfu sú tepelne odolné. Nukleotidy pridané DNA polymerázami sú adenín (A), guanín (G), cytozín (C) a tymín (T). Pretože DNA polymeráza môže pridávať nový nukleotid iba na 3 'koniec už existujúceho reťazca DNA, na začatie syntézy DNA je potrebný oligonukleotidový primer. Požiadavka priméru v PCR umožňuje vymedzenie iba špecifickej oblasti v templáte. Cieľová sekvencia je lemovaná forwardovými a reverznými primermi. Na konci PCR sa nové kópie nazývané amplikóny konkrétnej sekvencie DNA hromadia v miliardách. Komponenty PCR by mali byť optimalizované takým spôsobom, aby sa zlepšil výkon PCR a minimalizovalo zlyhanie.

PCR je automatizovaný proces vykonávaný tepelnými cyklami, ktoré sú schopné prepínať medzi rôznymi teplotami. PCR je trojstupňový proces.

1. Denaturácia -Dvojvláknový templát DNA sa rozdelí na dve jednoduché vlákna zahriatím na 94-95 ° C.
2. Žíhanie - Dopredné a reverzné priméry sa viažu na komplementárne sekvencie v templáte. Teplota v tomto kroku závisí od teploty topenia kombinácie primérov.
3. Predĺženie základného náteru - Enzým DNA polymeráza predlžuje každý z primérov na konci 3 pridaním komplementárnych báz k rastúcemu vláknu. Optimálna teplota Taq polymerázy, 72 ° C, sa používa ako teplota v kroku predĺženia. Čas predĺženia závisí od počtu párov báz v vlákne templátu.

Tieto tri kroky sa opakujú 28-35 krát.

Obrázok 1: Polymerázová reťazová reakcia

Produkty PCR sú frakcionované podľa veľkosti pomocou agarózovej gélovej elektroforézy v porovnaní s rebríkom DNA. Vizualizácia DNA na agarózovom géli sa vykoná zafarbením etídiumbromidom a pozorovaním pod UV. Amplifikované pásy DNA pod UV v géli zafarbenom etídiumbromidom sú znázornené na obrázku 2. Rebríček DNA je uvedený v jamke úplne vľavo.

Obrázok 2: Pásy DNA

Čo je RT-PCR

RT-PCR (Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia) je jednou z najcitlivejších techník používaných na detekciu mRNA. RNA je vhodný templát na zhromažďovanie informácií buď o génovej expresii normálneho tkaniva, alebo o génovej expresii infikovaného tkaniva. Šablónom pre RT-PCR môže byť celková RNA alebo vírusová alebo bakteriálna RNA. RNA je reverzne transkribovaná do komplementárnej DNA (cDNA) enzýmom, reverznou transkriptázou. Optimálna teplota reverznej transkriptázy je 46 ° C. CDNA sa používa v PCR na získanie produktu. Kroky v reverznej transkripčnej PCR sú znázornené na obrázku 3.

Obrázok 3: RT-PCR

RT-PCR sa môže uskutočňovať v dvojstupňových alebo jednostupňových reakciách. V dvojstupňovej reakcii sa reverzná transkripcia a PCR uskutočňujú v dvoch oddelených krokoch. V jednokrokovom RT-PCR nasleduje za reverznou transkripciou PCR v jednej skúmavke sekvenčným spôsobom. CDNA aj konečný produkt PCR je možné prevádzať na agarózovom géli na účely veľkostnej frakcionácie a vizualizácie. Jednokroková a dvojstupňová RT-PCR sú znázornené na obrázku 4.

Obrázok 4: Jednokroková a dvojstupňová RT-PCR

Rozdiel medzi PCR a RT-PCR

Definícia

PCR: PCR je technika používaná v molekulárnej biológii na amplifikáciu segmentu DNA generujúceho milióny kópií sekvencie DNA.

RT-PCR: RT-PCR je variant PCR používaný na detekciu génovej expresie v molekulárnej biológii.

Kroky

PCR: Denaturácia, žíhanie a predĺženie sú tri kroky v PCR.

RT-PCR: Pri RT-PCR nasleduje po reverznej transkripcii PCR.

Predloha

PCR: Dvojvláknová molekula DNA slúži ako templát pre PCR.

RT-PCR: Jednovláknová molekula RNA slúži ako templát pre reverznú transkripciu. Jednoreťazcová molekula DNA slúži ako templát pre PCR.

Použité enzýmy

PCR: DNA polymeráza sa používa ako enzým v PCR.

RT-PCR: Reverzná transkriptáza a DNA polymeráza sa používajú ako enzýmy v RT-PCR.

Primery

PCR: Pri PCR sa používajú predné a reverzné priméry.

RT-PCR: Na reverznú transkripciu sa používa iba reverzný primér a v PCR sa používajú forwardové aj reverzné priméry.

Citlivosť

PCR: PCR je citlivá metóda.

RT-PCR: RT-PCR je citlivejšia ako PCR.

Aplikácie

PCR: PCR sa používa na funkčnú analýzu génov, diagnostiku a monitorovanie dedičných chorôb, klonovanie DNA, sekvenovanie DNA a starodávnu amplifikáciu DNA.

RT-PCR: Na detekciu génovej expresie sa používa RT-PCR.

Záver

PCR a RT-PCR sú dve dôležité techniky používané v molekulárnej biológii. PCR aj RT-PCR sú automatizované techniky schopné exponenciálne zvýšiť počet kópií cieľovej sekvencie DNA, ktorý je definovaný priamymi a reverznými primermi. Pri PCR sa ako templát používa dvojvláknová DNA. Pomocou PCR sa môže uskutočniť klonovanie DNA, sekvenovanie DNA a funkčná analýza génov. Pri RT-PCR je možné génovú expresiu v konkrétnom tkanive pozorovať amplifikáciou RNA. Hlavný rozdiel medzi PCR a RT-PCR je v ich šablónach použitých v každej reakcii a ich aplikáciách.

Referencia:

1. „Polymerázová reťazová reakcia (PCR)“. Národné centrum pre biotechnologické informácie. Americká národná lekárska knižnica, n.d. Web. K dispozícii tu. 1. júna 2017. 2. „Polymerázová reťazová reakcia (alebo PCR)“. Klonovanie a molekulárna analýza génov. N.p., n.d. Web. K dispozícii tu. 1. júna 2017. 3. Biolabs, New England. "Syntéza CDNA a RT-PCR." Syntéza CDNA a RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. K dispozícii tu. 1. júna 2017.

Obrázok so súhlasom:

1. „Polymerázová reťazová reakcia“ Autor: Enzoklop-vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 2. „DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis“. Rainis Venta-Vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 3. „Reverzná transkripčná polymerázová reťazová reakcia“ Od Jpark623-Vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 4. „Jednosmerný vs dvojstupňový RT-PCR ”Od Jpark623-vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia