Hlavný rozdiel - PCR vs QPCR

PCR (polymerázová reťazová reakcia) a qPCR (kvantitatívna PCR) sú dve techniky používané v biotechnológii na amplifikáciu DNA na rôzne účely. PCR je relatívne jednoduchá technika. qPCR je tiež známy ako PCR v reálnom čase alebo digitálna PCR. The hlavný rozdiel medzi PCR a qPCR je to PCR je kvalitatívna technika, zatiaľ čo qPCR je kvantitatívna technika. PCR umožňuje čítanie výsledku ako „prítomnosti alebo neprítomnosti“. Ale v qPCR je kvantifikované množstvo DNA amplifikovanej v každom cykle. Ak sa v PCR používa RNA, táto metóda je známa ako RT-PCR (reverzná transkripčná PCR) a ak sa v qPCR používa RNA, je táto metóda známa ako qRT-PC.

Pokryté kľúčové oblasti

1. Čo je to PCR - Definícia, procesy, použitia 2. Čo je to QPCR - Definícia, procesy, použitia 3. Aké sú podobnosti medzi PCR a QPCR - Prehľad bežných funkcií 4. Aký je rozdiel medzi PCR a QPCR - Porovnanie kľúčových rozdielov

Kľúčové pojmy: elektroforéza na agarózovom géli, amplikóny, DNA polymeráza, fluorescenčné farbivo, PCR, sondy, qPCR, RT-qPCR

Čo je to PCR

PCR sa týka techniky v biotechnológii, ktorá umožňuje analýzu krátkej sekvencie DNA amplifikáciou vybraného segmentu DNA. Je to pomerne citlivá metóda, pretože jedinou reakciou sú požadované veľmi malé objemy. Táto technika je založená na schopnosti DNA polymerázy syntetizovať komplementárne nové vlákna DNA do ponúkaného templátového vlákna. Reakčná zmes PCR sa skladá z DNA polymerázy, DNA nukleotidov, primérov, DNA templátu, ktorý sa má amplifikovať, a horčíka. Amplifikácia sa vykonáva vo vnútri termocykléra. DNA polymeráza by mala byť odolná voči teplu, pretože pri tejto reakcii sa používajú vysoké teploty. Dva typy DNA polymeráz použitých v PCR sú Taq DNA polymeráza a Pfu DNA polymeráza. Taq DNA polymeráza je v PCR široko používaná.

Na syntetizáciu nového vlákna vyžaduje DNA polymeráza už existujúci reťazec DNA na 3 'konci. Preto sa do reakčnej zmesi pridá oligonukleotidový primer na začatie syntézy DNA. Požiadavka priméru v PCR umožňuje amplifikáciu iba špecifickej oblasti v templáte. Cieľová sekvencia je lemovaná forwardovými a reverznými primermi. Na konci PCR sa objavia nové kópie konkrétnej sekvencie DNA, ktoré sa nazývajú amplikony, sa hromadia v miliardách. Komponenty PCR by mali byť optimalizované takým spôsobom, aby sa zlepšil výkon PCR a minimalizovalo zlyhanie. Štandardná reakcia PCR je znázornená na obrázku 1.

Obrázok 1: PCR

Kroky PCR

Tri kroky PCR sú popísané nižšie.

1. Denaturácia -Dvojvláknový templát DNA sa rozdelí na dve jednoduché vlákna zahriatím na 94-95 ° C.
2. Žíhanie - Forwardové a reverzné priméry sa viažu na komplementárne sekvencie v templáte. Teplota závisí od teploty topenia kombinácie základného náteru.
3. Predĺženie základného náteru - Enzým DNA polymeráza predlžuje každý primér na svojom konci 3 pridaním komplementárnych báz k rastúcemu vláknu. Optimálna teplota Taq polymerázy, t.j. 72 ° C, sa používa ako teplota v kroku predĺženia. Čas predĺženia závisí od počtu párov báz v vlákne templátu.

Tieto tri kroky sa opakujú 28-35 krát. Na veľkostnú frakcionáciu produktov PCR sa používa elektroforéza na agarózovom géli. Produkt sa zafarbí etídiumbromidom a pozoruje sa pod UV. Produkt PCR alebo amplifikovaná DNA sa môže použiť na klonovanie, sekvenovanie alebo genotypizáciu.

Čo je to QPCR

QPCR sa týka techniky v biotechnológii, ktorá umožňuje detekciu, charakterizáciu a kvantifikáciu nukleových kyselín pre rôzne aplikácie. Ide teda o typ kvantitatívnej PCR. Ako qPCR je možné použiť DNA aj RNA. Ak sa ako templát použije RNA, mala by byť najskôr reverzne transkribovaná do cDNA. Tento typ qPCR je teda známy ako RT-qPCR. Tradičná PCR sa vykonáva pre cDNA alebo bežnú vzorku DNA. V qPCR sa však na označenie produktu PCR v každom kroku cyklu PCR používajú fluorescenčné farbivá. To umožňuje zber údajov v priebehu PCR, čo umožňuje kvantifikáciu amplikonov počas exponenciálnej fázy PCR. Hlavným typom farbiva používaného v qPCR je SYBR Green. Farbivo sa viaže na dvojvláknovú DNA. Pretože sa fluorescencia zvyšuje úmerne s množstvom amplifikovanej DNA, kvantifikáciu je možné vykonať v „reálnom čase“. Hlavnou nevýhodou použitia farbiva je, že umožňuje kvantifikáciu jedného konkrétneho produktu vo vzorke. V procese kvantifikácie je možné okrem farbív použiť aj sondy. Sondy TaqMan sú jedným z hlavných typov oligonukleotidových sond používaných v qPCR a proces fluorescenčnej emisie je znázornený na obrázku 2.

Obrázok 2: Sonda TaqMan

Sondy môžu byť navrhnuté tak, aby detegovali niekoľko produktov PCR v rámci tej istej vzorky. Sonda TaqMan je jedným z hlavných typov hydrolýznych sond; začlenenie tejto sondy do produktu PCR odkryje fluorofor a emituje fluorescenciu. Žiarivkové farbivá sú špecifickejšie pre produkt PCR. Preto sa používajú vo väčšine diagnostických testov na detekciu produktu PCR.

Podobnosti medzi PCR a QPCR

Rozdiel medzi PCR a QPCR

Definícia

PCR: PCR je technika v biotechnológii, ktorá umožňuje analýzu krátkej sekvencie DNA amplifikáciou vybraného segmentu DNA.

QPCR: QPCR je technika v biotechnológii, ktorá umožňuje detekciu, charakterizáciu a kvantifikáciu nukleových kyselín pre rôzne aplikácie.

Kvantitatívne/kvalitatívne

PCR: PCR je kvalitatívna technika.

QPCR: QPCR je kvantitatívna technika.

Detekcia produktu

PCR: Produkt sa deteguje elektroforézou na agarózovom géli v PCR.

QPCR: Produkt je možné detegovať v každom amplifikačnom cykle v qPCR.

Zhromažďovanie údajov

PCR: Dáta sa zbierajú na konci reakcie v PCR.

QPCR: Dáta sa zbierajú počas exponenciálnej fázy reakcie v qPCR.

Rozhodnutie

PCR: PCR má veľmi zlé rozlíšenie.

QPCR: QPCR má veľmi vysoké rozlíšenie.

Farbivá

PCR: PCR používa na farbenie produktu počas PCR etídiumbromid.

QPCR: Na detekciu produktu používa QPCR fluorescenčné farbivá.

Čas

PCR: PCR je časovo náročnejšia metóda.

QPCR: QPCR je časovo menej náročné.

RNA

PCR: RT-PCR je typ PCR, ktorý ako predlohu používa RNA.

QPCR: RT-qPCR je typ qPCR, ktorý používa RNA ako templát.

Úloha

PCR: PCR sa používa na detekciu prítomnosti alebo neprítomnosti určitých genómových fragmentov.

QPCR: QPCR sa používa na kvantifikáciu konkrétneho fragmentu vo vzorke.

Záver

PCR a qPCR sú dva typy techník používaných v biotechnológii na amplifikáciu DNA na rôzne účely. PCR je tradičná metóda amplifikácie používaná na identifikáciu prítomnosti alebo neprítomnosti fragmentu DNA. QPCR sa používa na kvantifikáciu konkrétneho fragmentu vo vzorke. PCR je teda kvalitatívna technika, zatiaľ čo qPCR je kvantitatívna technika. Toto je hlavný rozdiel medzi PCR a qPCR.

Referencia:

1. „QPCR vs. digitálna PCR vs. tradičná PCR.“ Thermo Fisher Scientific, k dispozícii tu.

Obrázok so súhlasom:

1. „PCR“ od spoločnosti Madprime-vlastná práca (CC BY-SA 3.0) prostredníctvom Commons Wikimedia2. „Taqman“ od používateľa: Braindamaged - vlastné dielo pôvodného používateľa, ktorý nahral (verejná doména) prostredníctvom Commons Wikimedia