The hlavný rozdiel medzi GFP a EGFP je to, že GFP (znamená zelený fluorescenčný proteín) je proteín, ktorý pri vystavení modrému svetlu vykazuje jasne zelenú fluorescenciu, zatiaľ čo EGFP (skratka pre zosilnený zelený fluorescenčný proteín) vykazuje silnejšiu fluorescenciu ako GFP. Okrem toho je ďalším ďalším dôležitým rozdielom medzi GFP a EGFP to, že GFP je proteín divokého typu izolovaný z medúzy Aequorea victoria. EGFP je však skonštruovaný variant pôvodného divokého typu.

GFP a EGFP sú dva typy proteínov, ktoré slúžia ako vnútorné chromofory. Na zobrazenie svojej farby nevyžadujú žiadne prídavné enzýmy/substráty, kofaktor alebo génové produkty. Oba sa preto používajú ako reportér génovej expresie v molekulárnej biológii.

Chromofor, EGFP, GFP, zelená fluorescencia, proteín divokého typu

Čo je to GFP

GFP (zelený fluorescenčný proteín) je proteín, ktorý zelene svieti pod modrým alebo UV svetlom. Prirodzene sa vyskytuje v medúze, Aequorea Victoria. GFP sa skladá z 238 aminokyselín. Veľkosť GFP je 26,9 kDa. GFP je účinný nástroj v molekulárnej biológii vďaka svojej vlastnej fluorescencii bez akejkoľvek prídavnej molekuly. Fluorescencia je spôsobená kovalentným preskupením susedných aminokyselín proteínu. Po zbalení proteínu tvoria atómy hlavného reťazca Ser65, Tyr66 a Gly67 vysoko konjugovaný, planárny p -hydroxybenzylidénimidazolinónový chromofor v prítomnosti 0₂. Štúdie kryštálovej štruktúry ukazujú, že balenie chromoforu v jadre ß-barelovej štruktúry molekuly ju chráni pred kalením paramagnetickým kyslíkom, vodnými dipólmi alebo cis-trans izomerizáciou. Nekovalentné interakcie chromoforu so susednými molekulami navyše zlepšujú jeho spektrálne vlastnosti.

Obrázok 1: Stužková reprezentácia GFP a fluoroforu

GFP môže byť zavedený do organizmu počas transgénnych modifikácií. Je možné ho udržiavať aj po generácie. Hlavnou nevýhodou GFP divokého typu je znížená účinnosť proteínu pri zobrazovaní buniek spôsobená nízkoúčinným skladaním pri fyziologických teplotách, ako je 37 ° C, ktoré znižujú fluorescenčný signál. Rýchlosť zrenia GFP vo vnútri hostiteľskej bunky je tiež pomalá, zatiaľ čo má tendenciu agregovať sa. V dôsledku prítomnosti dvoch rôznych foriem chromoforu je možné pozorovať dva excitačné vrcholy. Proteínové inžinierstvo však vyriešilo väčšinu problémov zavedením variantných foriem divokého typu GFP.

Čo je EGFP

EGFP (zosilnený zelený fluorescenčný proteín) je variantom GFP divokého typu s emisiou vyššej intenzity vzhľadom na GFP. Je to jeden z prvých a najdôležitejších variantov GFP. Tieto dve mutácie, F64L a S65T, generujú EGFP s vyššou účinnosťou skladania pri 37 ° C. Je zaujímavé, že EGFP má jeden excitačný pík pri ~ 490 nm v dôsledku potlačenia 395 nm píku pomocou S65T, pretože moduluje ionizovaný stav Glu222 v blízkosti. Na druhej strane F64L zvyšuje účinnosť skladania pri 37 ° C. Dôležité je, že kodónová sekvencia EGFP je optimalizovaná na expresiu v cicavčích bunkách.

Obrázok 2: EGFP expresia

Podobnosti medzi GFP a EGFP

Rozdiel medzi GFP a EGFP

Definícia

GFP: Proteín divokého typu, ktorý vykazuje zelenú fluorescenciu pod modrým alebo UV svetlom a prirodzene sa vyskytuje v medúze, Aequorea Victoria

EGFP: Variant divokého typu GFP s emisiami vyššej intenzity vzhľadom na GFP

Znamenať

GFP: Zelený fluorescenčný proteín

EGFP: Vylepšený zelený fluorescenčný proteín

Pôvod

GFP: Divoký typ

EGFP: Mutant

64^th Aminokyselina

GFP: Fenylalanín

EGFP: Leucín

65^th Aminokyselina

GFP: Serine

EGFP: Treonín

Jas farby

GFP: Svetlozelená

EGFP: Jasnejšia zelená

Vrcholy vzrušenia

GFP: Dva vrcholy (395 nm a 490 nm)

EGFP: Jeden vrchol (490 nm)

Účinnosť skladania pri 37 ° C

GFP: Nízka

EGFP: Vysoká

Záver

GFP je proteín divokého typu, ktorý pri pôsobení modrého alebo ultrafialového svetla vykazuje jasne zelenú fluorescenciu. EGFP je variantom GFP, ktorý vykazuje vyššiu intenzitu fluorescencie v porovnaní s GFP. Hlavným rozdielom medzi GFP a EGFP je teda intenzita zelenej fluorescencie, ktorú každý proteín emituje.

Referencia:

1. Arpino, James A. J., et al. "Kryštálová štruktúra vylepšeného zeleného fluorescenčného proteínu s rozlíšením 1,35 Å odhaľuje alternatívne konformácie pre Glu222." PLOS Medicine, Public Library of Science, journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0047132.

Obrázok so súhlasom:

1. „Gfp a fluorofor“ od Raymonda Kellera (Raymond Keller (diskusia)), pod záštitou Crystal Protein. - Vlastná práca (Public Domain) via Commons Wikimedia 2. „Fgams ppat egfp puncta“ Autor: Zhao A, Tsechansky M, Swaminathan J, Cook L, Ellington AD, et al. (2013) Prechodne transfekované purínové biosyntetické enzýmy tvoria stresové telá. PLoS ONE 8 (2): e56203. doi: 10.1371/journal.pone.0056203 (CC BY 3.0) cez Commons Wikimedia