The hlavný rozdiel medzi extrakciou DNA a RNA je to, že úroveň pH je Extrakcia DNA má pH 8, zatiaľ čo hladina pH extrakcie RNA je pH 4,7. DNA má tendenciu denaturovať a pri kyslom pH sa presúva do organickej fázy. Pri alkalickom pH RNA podlieha alkalickej hydrolýze v dôsledku prítomnosti 2'OH v ribózovom cukre.

Extrakcia DNA a RNA sú dva postupy zahrnuté v izolácii a čistení nukleových kyselín z buniek tkanív. Oba postupy pozostávajú z troch krokov. Dobrá kvalita DNA a RNA hrá rozhodujúcu úlohu v molekulárnych biológiách, biotechnológiách, genomike a epidemiologických experimentoch.

Pokryté kľúčové oblasti

1. Čo je to extrakcia DNA - Definícia, postup 2. Čo je to extrakcia RNA - Definícia, postup 3. Aké sú podobnosti medzi extrakciou DNA a RNA - Prehľad bežných funkcií 4. Aký je rozdiel medzi extrakciou DNA a RNA - Porovnanie kľúčových rozdielov

Kľúčové pojmy: bunková lýza, denaturácia bielkovín, extrakcia DNA, pH, zrážanie, extrakcia RNA

Čo je extrakcia DNA

Extrakcia DNA je postup izolácie a čistenia DNA. DNA je možné izolovať z krvi, vzoriek zmrazeného tkaniva alebo blokov parafínového tkaniva. Tri kroky extrakcie DNA sú lýza buniek, izolácia DNA a zrážanie. Počas lýzy buniek sa bariéry bunkovej membrány, ako sú bunkové membrány a membrány jadra, rozbijú, aby sa odhalila DNA. Ďalším krokom je odstránenie membránových lipidov zo vzorky. Nakoniec zrážanie DNA zahŕňa odstránenie proteínov spojených s DNA proteázou a odstránenie RNA pomocou RNázy.

Obrázok 1: Postup extrakcie DNA

Základné protokoly o extrakcii DNA

Nasledujú základné protokoly o extrakcii DNA.

1. Bunková lýza pufrom na lýzu buniek na lýzu bunkových membrán

2. Lipidy sa rozkladajú saponátmi a povrchovo aktívnymi látkami

3. Trávenie bielkovín pridaním proteázy

4. Štiepenie RNA pridaním RNázy

5. Separácia bunkových zvyškov, štiepených bielkovín, lipidov a RNA pridaním koncentrovanej soli s následnou centrifugáciou

6. Zrážanie DNA etanolom s ľadovo chladným etanolom alebo izopropanolom. Na zlepšenie zrážania je možné použiť iónovú silu octanu sodného. Vyzrážaná DNA sa vo finálnom roztoku javí ako vlákna.

Obrázok 2: Extrahovaná DNA

Na oddelenie DNA od proteínov je možné použiť aj extrakciu fenol-chloroformom. Tu fenol denaturuje proteíny vo vzorke a DNA zostáva na konci extrakcie vo vodnej fáze. A v organickej fáze nájdete denaturované proteíny. Ďalšou metódou na extrakciu DNA je minikolonová purifikácia. Väzba DNA do kolóny tu závisí od pH a koncentrácie soli pufra.

Čo je to extrakcia RNA

Extrakcia RNA sa týka procesu čistenia RNA zo vzoriek. Bežný spôsob extrakcie RNA sa nazýva extrakcia guanidíniumtiokyanát-fenol-chloroformom. Guanidíniumtiokyanát denaturuje proteíny. Okrem toho narúša vodíkové väzby molekúl vody a slúži ako chaotropné činidlo. Na extrakciu RNA sa používa špeciálne činidlo nazývané Tri-činidlo. Obsahuje guanidíniumtiokyanát, fenol a octan sodný. Účel základných krokov extrakcie RNA je podobný ako pri extrakcii DNA. Protokol na extrakciu RNA je popísaný nižšie.

1. Bunky sa premyjú ľadovo chladným PBS, aby sa zachovala osmolarita buniek.

2. Odsajte bunky a homogenizujte vzorku Tri-reagentom.

3. Pridajte chloroform a pretrepte.

4. Centrifugácia môže mať za následok tri vrstvy. Horná vrstva je vodná vrstva, ktorá je číra. Stredná vrstva alebo interfáza obsahuje vyzrážanú DNA. Spodná vrstva je organická vrstva, ktorá je ružová.

5. Odstráňte vodnú vrstvu a pridajte izopropanol. Centrifugácia môže viesť k vzniku peliet.

6. Peletu umyte 75% etanolom. Pelet usušte na vzduchu.

7. Peletu rozpustite v TE pufri alebo vode.

Obrázok 3: Fenolová-chloroformová extrakcia RNA

Extrakcia RNA sa spravidla uskutočňuje pri pH nižšom ako 7. Pri alkalickom pH je RNA náchylnejšia na degradáciu alkalickou hydrolýzou v dôsledku prítomnosti skupiny OH v 2 'polohe ribózového cukru. Okrem toho má RNA tendenciu zostať vo vodnej fáze pri kyslom pH. Na druhej strane má DNA tendenciu denaturovať a pri kyslom pH sa presúva do organickej fázy. Extrakciu DNA je preto možné vykonávať približne pri pH 8. DNA je tvorená deoxyribózovým cukrom a nepodlieha alkalickej hydrolýze.

Podobnosti medzi extrakciou DNA a RNA

Rozdiel medzi extrakciou DNA a RNA

Definícia

Extrakcia DNA: Izolácia a purifikácia DNA

Extrakcia RNA: Proces purifikácie RNA zo vzoriek

Extrahovaný typ nukleovej kyseliny

Extrakcia DNA: DNA

Extrakcia RNA: RNA

pH

Extrakcia DNA: Dané o 8

Extrakcia RNA: Dané 4.7

Kroky

Extrakcia DNA: Porušenie bunkových membrán alebo lýza buniek, odstránenie lipidov membrány a vyzrážanie DNA

Extrakcia RNA: Bunková lýza, guanidíniumtiokyanát-fenol-chloroformová extrakcia, prípravok s izopropanolom

Použitie vody upravenej DEPC

Extrakcia DNA: Žiadny

Extrakcia RNA: Všetky činidlá sa pripravia s vodou upravenou DEPC

Skladovanie

Extrakcia DNA: DNA môže byť extrahovaná vopred a je uložená v dávkach

Extrakcia RNA: Extrakcia RNA sa robí tesne pred následnými postupmi

Dlhodobé úložisko

Extrakcia DNA: Pri -20 ° C

Extrakcia RNA: Pri -80 ° C

Záver

Extrakcia DNA sa uskutočňuje pri pH 8. DNA má tendenciu prechádzať do organickej fázy, pretože denaturuje pri kyslom pH. Extrakcia RNA sa však vykonáva pri nízkom pH, aby sa zabránilo degradácii alkalickou hydrolýzou. Základný účel krokov extrakcie DNA a RNA je podobný. Hlavným rozdielom medzi extrakciou DNA a RNA sú podmienky pH používané pri každom type extrakcie.

Referencia:

1. „Základy extrakcie DNA“. Aljaška BioPREP virtuálna učebnica, Aljaška BioPREP University of Aljaška Fairbanks, k dispozícii tu2. „Protokol izolácie RNA a reverznej transkripcie: Bunky v kultúre.“ abcam, k dispozícii tu

Obrázok so súhlasom:

1. „Obrázok 17 01 02“ od CNX OpenStax-(CC BY 4.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 2. „Extrakcia DNA“ od Joo Nath-vlastná práca (CC BY-SA 4.0) prostredníctvom Commons Wikimedia 3. „Extrakcia PhOH-CHCl3“ Od Squidonius (diskusia)-Vlastná práca (Pôvodný text: vlastnoručne vyrobený) (Public Domain) cez Commons Wikimedia